试验目的

 本研究旨在探讨甘露寡糖(MOS)和低聚木糖(XOS)两种益生元对肠炎沙门氏菌感染鸡的盲肠菌群和细胞因子表达的影响。 

试验设计

 选取150只新孵商业肉仔鸡，随机分为5组（每组6个重复，每个重复5只）：(1)NC组：未受感染对照组（无病鸡饲喂标准饲粮），(2)PC组：感染对照组（病鸡饲喂标准饲粮），(3)XOS组：感染+XOS（病鸡饲喂添加有2 g/kg XOS的标准饲粮），(4)MOS组：感染+MOS（病鸡饲喂添加有1 g/kg MOS的标准饲粮），(5)VIRG组：感染+维吉尼亚霉素（病鸡饲喂添加有16.5 g/t维吉尼亚霉素的标准饲粮）。

 试验共计5d。XOS纯度为95%，聚合度(DP)为2~7。

 本研究采用从中国兽医菌种采集中心获得的一株具有新生霉素耐药性的肠炎沙门氏菌(CVCC3378)感染肉鸡。QPCR分析用引物如表1所示。

  试验结果

（1）感染后盲肠肠炎沙门氏菌计数

 如图1所示，取每只肉鸡含内容物的盲肠均质，并在选择性培养基上培养，测定接种肠炎沙门氏菌的种群数量。未感染组盲肠未发现肠炎沙门氏菌菌落。感染后第1天，各组间无显著差异。然而，在感染后第3天，与PC组相比，MOS组的鸡肠沙门氏菌数量减少了1.25 log。感染后第5天，MOS组和XOS组肠炎沙门氏菌的平均计数分别显著低于PC组1.62和1.01 log。在任何采样时间，VIRG处理均未显著影响肠炎沙门氏菌的定殖。

 （2）盲肠微生物群落分析

 如表2所示，从90份盲肠标本中共获得16S rRNA V1-V3区序列955877条。剔除低质量和嵌合序列后，保留843947条序列用于下游分析。每个样本保留的平均读数为9377个(±3094个标准偏差(STD))，所有样本的中位读数长度为482个(±86 STD)碱基。去除低丰度OTUs(<总OTUs 的0.005%)后，还剩下4742个OTUs供进一步分析。通过计算Chao1指数、PD(整树)和观察到的OTU数量来评估下采样(4000 reads)OTU表的α多样性。肠炎沙门氏菌的定殖和饲粮添加均未显著改变盲肠菌群α多样性指数。

 为了估计盲肠微生物群落之间的β多样性，使用了加权和未加权的UniFrac距离矩阵。未加权UniFrac的ANOSIM显示，饲粮添加和肠炎沙门氏菌感染没有相关性。相比之下，当考虑类群的相对丰度(加权UniFrac距离矩阵)时，在感染后第3天和第5天，各组之间观察到显著(P<0.01)但微弱(0.1<R<0.5)的视觉分离(表3和图2)。采用LEfSe方法检测各组间差异最大的受影响类群(LDA>2)组之间。未感染组(NC)瘤胃球菌、粪球菌和毛螺菌科的相对丰度分别为15.8%、20.1%和8.2%，高于PC组(0.5%、0.4%和5%)(图3A)。

 将所有感染组进行比较，LEFSe显示，饲喂XOS的肉鸡中乳酸菌属(30% vs 10%)、蔷薇菌属(0.15% vs 0.04%)和梭状芽孢菌属(0.32% vs 0.07%)增加，而饲喂MOS的肉鸡中瘤胃球菌属(3% vs 0.5%)、粪球菌属(0.9% vs 0.01%)和肠球菌属(2% vs 0.02%)物种增加(图3B)。VIRG处理不影响盲肠细菌群的相对丰度。

（3）盲肠集合淋巴样组织细胞因子基因表达

 如图4所示，为了确定肠炎沙门氏菌感染或饲粮处理是否改变了肠道免疫功能，我们使用qPCR方法评估了各种炎症相关细胞因子的基因表达。接种PBS或肠炎沙门氏菌一天后，NC对照组的白介素6 (IL-6)、脂多糖诱导肿瘤坏死因子α因子(LITAF)、干扰素(IFN)-γ和转化生长因子(TGF)-β的相对表达显著低于PC对照组(图4A)。在感染后1天，与PC组相比，饲喂XOS、MOS或VIRG显著降低了促炎细胞因子、IL-6和LITAF的表达(图4A)；同时，IL-10在VIRG中表达明显增加，而XOS组表达减少。在感染后1天和3天，与PC组相比，MOS处理(而非XOS)显著降低了IFN-γ的表达(图4A和B)。感染后第3天，与IFN-γ相似，LITAF的相对表达量在MOS组中降低，而在XOS组中没有降低(图4B)。肠炎沙门氏菌感染后第3、5天，饲粮添加组间IL-6、IL-10、TGF-β表达水平无显著变化(图4B、C)。

（4）盲肠微生物群落结构与炎症反应的多因素分析

 为了进一步研究盲肠菌群与宿主免疫应答之间的相互作用，我们采用CCA方法，在属水平上研究细胞因子基因(IL-6、IL-10、LITAF、IFN-γ和TGF-β)相对表达与盲肠细菌组成之间的多元结构。DCA的结果表明，采用CCA的单峰模型是直接梯度分析的合适排序方法。CCA结果显示，不同组盲肠样本中宿主盲肠炎症反应(IL-6、IL-10、LITAF、IFN-γ、TGF-β)与细菌组成均有较强相关性(表4、图5)。IL-6、IL-10、LITAF、IFN-γ和TGF-β的相对表达量与细菌组成在属水平上一致。IL-10的作用最显著，其次是IFN-γ、IL- 6、LITAF和TGF-β基因。蒙特卡罗排列检验表明，宿主盲肠炎症反应与细菌组成在属水平上存在显著相关(P=0.032)。

试验结论

 综上所述， XOS益生元降低了病原菌的盲肠定植和炎症细胞因子的产生，对雏鸡肠炎沙门氏菌具有保护作用。

参考文献：

Mohsen·Pourabedin/Pourabedin M;Qiaoling·Chen/Chen Q;MingMing·Yang/Yang M;Xin·Zhao/Zhao X.Mannan- and xylooligosaccharides modulate caecal microbiota and expression of inflammatory-related cytokines and reduce caecal Salmonella Enteritidis colonisation in young chickens.[J].FEMS microbiology ecology,2017,Vol.93(1).