试验设计 试验设计：喂食小鼠添加XOS或标准玉米淀粉作为对照的改良天然1430 Altromin饮食，其量等于碳水化合物部分的10%。 组织学分析:以盲法对13周龄小鼠的每个胰腺中至少50个胰岛和每个唾液腺的8个连续切片进行胰岛炎和涎腺炎评分。 肠道微生物群组成分析：取自4周龄未经处理和经抗生素处理的给予对照或XOS补充饮食的雌性NOD小鼠的粪便，以及7周龄接受来自对照和XOS喂养NOD小鼠的粪便微生物群移植的NOD小鼠，进行DNA提取、基于标签编码的16S rRNA基因扩增子MiSeq测序和测序分析，以及来自粪便和肠系膜淋巴结的细菌DNA实时定量PCR（qPCR）。 饮食对代谢和葡萄糖耐量的影响：对于OGTT（口服葡萄糖耐量试验），8周龄的小鼠在口服75 mg/小鼠的葡萄糖之前禁食6 h；测量在葡萄糖挑战后的0、15、30、60、90和120 min小鼠血糖，以及对小鼠的血清进行循环胰岛素和瘦素水平分析。 SCFA分析：从13周龄的小鼠身上取下结肠内容物，通过气相色谱法测量SCFA浓度。 胰高血糖素样肽-1分析：收集13周龄小鼠的血清样本，使用发光氧导免疫测定法（LOCI）分析胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的总水平。 肠道通透性：在7周龄的小鼠禁食禁水4 h后，口服600 mg/kg FITC-葡聚糖，进行体内肠道渗透性检测；测量收集自13周龄小鼠血清中的人连蛋白（Zonulin）浓度。 定量PCR的基因表达：13周龄的小鼠被杀死后，对结肠和回肠片段进行RNA分离和cDNA合成。Muc1、Muc2、Ocln和Tjp1用于评估肠道屏障，Arg1、Tgfβ（也称为Tgfb1）；Gzmb、Fasl和Cd8a TaqMan基因表达检测用于巨噬细胞，调节性和细胞毒性T细胞相关基因用于qPCR分析。 流式细胞仪分析XOS饮食的潜在抗炎作用：小鼠在13周龄时被杀死，用抗体混合物对CD3-FITC、NK/NKT-PE、CD8-APC、CD11c-FITC、F4.80-PerCP-CY5.5、CD4-PerCP-CY5.5、forkhead box P3 (FOXP3)-PE和CD69-APC在肠系膜、胰腺淋巴结和脾脏单细胞悬液中进行染色。 试验结果 （1）饮食中的XOS调节NOD小鼠的自身免疫表现 如图1a所示，摄入XOS补充饮食25周后，糖尿病发病率明显降低（分别为26%和50%），30周龄时发病率不再有差异；但与对照饮食相比，XOS喂养小鼠的糖尿病发病时间明显推迟（图1c）；图1b显示将XOS和对照组喂养的小鼠的粪便微生物群移植到安置在无菌隔离器中经抗生素处理的NOD小鼠的幼崽身上，并不足以转移糖尿病发病的延迟；对胰腺和唾液腺进行组织学分析结果显示，低聚木糖（XOS）对唾液腺病灶大小和数目的影响非常明显，而对胰腺的影响则较为温和（图1d和1e）。
（2）饮食对经抗生素处理的小鼠的胰岛和唾液腺炎的影响 如图1e和图1f所示，经抗生素处理的对照饮食小鼠完全发展为胰腺炎，其程度与未经处理的小鼠相同；在断奶前只喂食补充XOS饮食的小鼠中，胰腺炎轻微下降，而在同时给予抗生素的小鼠中胰腺炎减少的更多；雄性NOD小鼠发生的胰腺炎比使用抗生素的雌性小鼠要少，但在喂食XOS的补充饮食时更少（图1g-1h）。 如图1d所示，当评估同一组小鼠的唾液腺炎程度时，发现生命早期的XOS饮食足以降低生命后期的唾液腺炎评分；用抗生素处理的对照组和XOS喂养的小鼠都出现了与未处理的XOS喂养小鼠相同的低程度唾液腺炎。 如图2a和2b所示，PCoA在4周龄时由于饮食的原因显示出明显的集群（基于未加权和加权UniFrac距离矩阵的PERMANOVA：分别为p<0.05，R2=0.15和p<0.05，R2=0.18），这种分离主要是由副杆菌属以及四个丰度较低（<2%）的属驱动的，与对照组小鼠（1%）相比，XOS喂养小鼠的丰度相对较高（12%）（图2e）。
（3）抗生素减少肠道微生物群 如图2j所示，通过16S rRNA基因（V3区域）qPCR发现抗生素可使16S的总拷贝数减少4000倍以上；扩增子测序表明饮食组中剩余的少数细菌主要由链球菌属组成，达到扩增子丰度的98%（±1%）（图2f）；此外，与对照组（0%）抗生素处理的小鼠相比，只有一个丰度很低的属即黄杆菌属，在XOS喂食的小鼠（占剩余微生物组的0.1%）显著升高（图2g）；这种低丰度分类群的单一差异是导致两个饮食组在未加权PCoA图中单独聚类的主要原因：P<0.05, R2= 0.086（图2c）；因此在加权PCoA图中无法观察到差异：P=0.17，R2= 0.17（图2d），综合来看，数据表明XOS对胰腺炎有直接的微生物群独立性影响。 （4）益生元对肠道屏障功能和粘膜炎症的改善 如图3a所示，与喂养对照组饮食的小鼠相比，喂养XOS小鼠的屏障渗透性确实较低；图3c显示肠系膜淋巴结中16S rRNA基因的qPCR也证实了这一点，显示与对照组小鼠相比，喂食XOS的小鼠中能够穿过肠道屏障并到达引流淋巴结的微生物较少；如图3e、3h所示，与黏液相关的基因在低聚木糖（XOS）组小鼠回肠（Muc2）和结肠（Muc1）中也表达上调；图3i-l显示，其他屏障相关基因，如Ocln和Tjp1（分别编码闭锁素和紧密连接蛋白1）在早期喂食低聚木糖（XOS）的小鼠回肠和结肠中均显著上调。图3i-j结果表明在生命早期补充XOS似乎以独立于微生物的方式调节这些部分的屏障功能，因为这种差异在抗生素处理的小鼠中持续存在。 如图3b所示，代表回肠屏障功能的FITC-葡聚糖试验以及图3k、3l回肠组织中的基因表达都没有显示出抗生素处理小鼠的屏障得到改善；图3d表明两个饮食组的血清中该蛋白的水平是相似的。
（5）微生物群介导的粘膜炎症的饮食变化 如图4a、4b所示，与对照组小鼠相比，XOS喂养的小鼠在胰腺和肠系膜淋巴结以及脾脏中的CD8+NKT细胞和细胞毒性CD8+T细胞的水平较低；图4c-e中，Cd8a、Gzmb和Fasl qPCR也能证实，显示这些基因的表达在XOS喂养的小鼠中被类似地下调，但在断奶时转为对照饮食的小鼠中却没有。 如图4f所示，与对照组小鼠相比，XOS喂养的小鼠局部淋巴结中活化（CD69+）调节性T细胞的比例略高；图4j显示在生命早期喂食XOS饮食的小鼠中，Tgfβ基因的表达水平更高，这进一步表明局部环境更加抗炎；此外，图4g显示F4.80+巨噬细胞在局部和全身都被XOS饮食所诱导。然而，图4 h表明刺激炎症的典型CD11c+M1巨噬细胞的比例，在XOS喂养的小鼠脾脏中减少了；巨噬细胞数量的增加可能是由于抗炎的M2巨噬细胞的增加，它们也是TGF-β的主要生产者；图4i显示 M2巨噬细胞标志物Arg1（编码精氨酸酶1）的基因表达也表明了这一点，该标志物在XOS喂养的小鼠中表达水平更高。
如图5a所示，通过将XOS和对照组喂养的NOD小鼠的脾细胞移植到NOD/SCID小鼠身上，结果在两组中移植都诱发了糖尿病，且XOS组的影响更大；图5b显示将移植的XOS和对照组喂养NOD小鼠中的脾细胞在生命早期用抗生素处理，结果两组之间的糖尿病发病率是相似的，这与图5e、5f中抗生素处理的小鼠中CD8+免疫细胞缺乏差异很对应。
试验结论 本文研究了益生元低聚木糖（XOS）对NOD小鼠胰岛和唾液腺炎症的影响，并测试了这些是否由肠道微生物群介导，结果雌性NOD小鼠及其后代在糖尿病发病前或断奶前，喂食含有低聚木糖（XOS）的饮食组小鼠的1型糖尿病的发病显著推迟，且胰岛及唾液腺中的细胞浸润显著减少；菌群移植无法转移低聚木糖（XOS）饮食延缓1型糖尿病发病的保护作用。小鼠经抗生素处理后，喂食低聚木糖（XOS）组小鼠及对照组小鼠的唾液腺炎症无显著差异，但低聚木糖（XOS）组小鼠的胰岛炎症显著减少。低聚木糖（XOS）饮食显著降低了小鼠肠道通透性，并促进M1到M2巨噬细胞的转变，增加活化调节性T细胞的丰度。以上结果表明，益生元 XOS对唾液腺炎症具有微生物群依赖性的影响，对胰岛病理学具有微生物群独立性的影响，这些影响伴随着肠道屏障的改善。
参考资料： Hansen C H F, Larsen C S, Petersson H O , et al. Targeting gut microbiota and barrier function with prebiotics to alleviate autoimmune manifestations in NOD mice[J]. Diabetologia, 2019, 62(4).
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