试验设计

 原料：临沂产鲁黑豆2号品种的大粒黑豆；济宁产神农架品种的大粒黑豆；黑龙江产哈尔滨小黑豆品种的小粒黑豆；低聚木糖。

 实验方法：

 大豆抗毒素诱导与合成确认：

 ①XOS诱导：将无霉斑、粒径一致且颗粒饱满的黑豆用75%乙醇处理3 min，灭菌蒸馏水清洗若干次，置于25℃左右的灭菌水中浸泡5 h；然后用无菌刀片将膨胀的种子分为2片子叶，在子叶表面划出约9～12 mm²的伤口，且背面不发生破裂；将子叶置于培养皿内润湿的无菌滤纸上，向伤口内加入60 µL无菌过滤XOS溶液并用封口膜密封，在相对湿度（RH）65%、24～26℃条件下暗培养若干天。对照黑豆子叶处理方法如上，伤口加入60 µL灭菌水。样品提取步骤如下：子叶经冻干研磨后 ，称取0.3 g粉末于离心管中，以料液比（g·mL^-1）为1∶6的比例加入1.8 mL 80%乙醇，盖严并浸在50℃水浴中 ，磁力搅拌提取1 h，以15000 r·min^-1离心15 min，取上清液过0.22 µm有机滤膜，即得粗提液。

 ②大豆抗毒素合成确认：粗提液经半制备HPLC仪-收集器分离馏分、高效液相色谱（HPLC）分析及超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）确认；半制备HPLC方法采用Waters 600E（配备Waters PAD检测器）；YMC-Pack ODS-AQ C18（20 mm×250 mm，5 µm）制备色谱柱；流动相A、B为90%乙腈水与5%乙腈水，流速3.0 mL·min^-1，进样体积2 mL，波长285 nm，检测时间90 min；梯度洗脱：0～10 min，100%B；10～70 min，100%B→0%B；70～90 min，0%B；大豆抗毒素含量测定采用Waters 2695 HPLC-2996 PDA检测器及色谱工作站；SunChrom反相C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），柱温40℃；流动相A、B为pH 3.0乙酸水与乙腈，流速1.0 mL·min^-1，洗脱方法如表1所示；进样体积10 µL，波长285 nm，检测时间65 min，含量计算依据课题组建立的大豆抗毒素积分值（Y）对质量浓度（X）的回归方程：Y=1.0×10⁷X+754.32，R²=0.9999。

 3个产地黑豆中大豆抗毒素诱导合成量的比较：不同产地黑豆在XOS诱导含量4.0%，诱导时间3 d，培养温度25℃时，比较大豆抗毒素的合成累积量。

 单因素试验：分别研究诱导时间、XOS质量浓度、培养温度对大豆抗毒素合成量的影响，其中，诱导时间单因素试验：XOS质量浓度4.0 g·100 mL⁻¹，培养温度25℃，设置诱导时间分别为1、2、3、4、5、6和7 d；XOS质量浓度单因素试验：诱导时间分别为4 d，培养温度25℃，设置XOS质量浓度2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和 8.0 g·100 mL⁻¹；培养温度单因素试验：诱导时间4 d，XOS质量浓度4.0 g·100 mL⁻¹，设置培养温度分别为17、21、25、29和33℃，进行XOS诱导大豆抗毒素合成条件的优化。

响应面试验：利用CCD-RSM对大豆抗毒素合成条件进行综合优化，将自变量诱导时间（X₁）、XOS诱导质量浓度（X₂）及培养温度（X₃）编码为五水平，即-1.682、-1、0、+1、+1.682，各因素水平为诱导时间2～6 d、XOS诱导质量浓度3.0～7.0 g·100 mL⁻¹、培养温度17～33℃（表2）；试验设计含20个试验点（14个析因点和6个零点）（表3），在响应面试验中，应用Design-Expert 8.0.6软件进行三因素五水平的CCD-RSM试验，获得XOS诱导黑豆子叶中大豆抗毒素累积量的优化条件及其下的预测值，此外，对模型的显著性与适用性进行方差分析。

优化条件验证：对获得最高诱导量的大豆抗毒素优化条件进行验证，检验结果与软件获得的预测值是否一致。

试验结果

（1）大豆抗毒素合成确认

 由图1A可知，在XOS诱导子叶组织而获得提取物的HPLC谱图中，新产生化合物的色谱峰保留时间约在22.5 min，相较与对照谱图（图1B）没有出现；通过半制备HPLC仪分离获得受刺激子叶组织中合成的新化合物，HPLC分析确认及纯化浓缩馏分中的化合物，且利用HPLC与UPLC-MS/MS对浓缩液进行检测分析，结果显示，分离纯化得到的新化合物的HPLC谱图如图1C所示；采用电喷雾离子源正离子（ESI+）模式下的UPLC-MS/MS对新化合物分析，由于3种最常见GLY异构体Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ的分子式与分子量分别为C₂₀H₁₈O₅与338，得出质谱图中质荷比（m/z）339是大豆抗毒素质子化得到的准分子离子[M+H]⁺，同时m/z 321为[M+H]⁺丢失1个水分子产生的碎片离子[M+H-H₂O]⁺，m/z 229为[M+H-H₂O]⁺丢失1个苯氧基团产生的碎片离子[M+H-H₂O-C₆H₄O]⁺（图1D），由获得的质谱数据得到，在受到外源刺激的子叶组织提取物的色谱图中，保留时间约22.5 min的新合成化合物确认为GLY Ⅰ、GLY Ⅱ与GLY Ⅲ，由上可知，XOS对黑豆子叶组织的外源诱导刺激作用能够导致子叶组织合成和积累次生代谢产物GLYs，同时 GLYs的诱导合成也是子叶组织细胞对XOS刺激作出的防御性反应中的一部分。

（2）不同产地黑豆子叶中GLYs含量的分析

 由图2可知，在XOS诱导质量浓度4.0 g·100 mL^-1与诱导时间3 d条件下，临沂产大粒黑豆、济宁产大粒黑豆与黑龙江产小粒黑豆中GLYs累积量分别为1.4252、0.9732、0.8990 mg·g^-1 DW，其中，济宁产大粒与黑龙江产小粒黑豆子叶中GLYs累积量显著低于临沂产大粒黑豆，而济宁产大粒与黑龙江产小粒黑豆间无显著差异，由上可得，临沂产大粒黑豆更适用于后续GLYs诱导合成条件优化的响应面试验。

（3）GLYs合成条件的优化

 由图3可知，当诱导时间为2 d时，GLYs累积量达到较高水平，此后随着时间的延长累积量增加不明显；当XOS质量浓度为4.0 g·100 mL⁻¹，培养温度为25℃，在诱导时间2～6 d下的GLYs累积量差异不显著（P>0.05），故诱导时间选择2～6 d；当XOS诱导质量浓度在2.0～8.0 g·100 mL⁻¹时，GLYs累积量发生明显变化，而当诱导时间与培养温度一定时，诱导质量浓度为4.0 g·100 mL^-1时合成GLYs量显著高于8.0%时的累积量（P<0.05），与7.0%时的累积量差异不显著（P>0.05），考虑到GLYs积累量及XOS诱导质量用量，故诱导质量浓度选择在2.0~6.0 g·100 mL⁻¹；当诱导时间与诱导质量浓度一定时，培养温度25℃下的GLYs累积量显著高于其他培养温度（P<0.05），17～33℃范围的GLYs含量发生明显变化，故选择此培养温度范围，综合单因素试验结果，诱导时间2～6 d、诱导质量浓度2.0～6.0 g·100 mL⁻¹及培养温度17～33℃为中心组合设计响应面试验进行的单因素水平范围。

（4）中心组合设计-响应面试验的分析

 以单因素试验结果为基础，采用三因素五水平的CCD-RSM试验优化GLYs合成的诱导条件，表3为CCD-RSM试验设计及GLYs含量结果，应用 Design-Expert 软件对数据进行多元回归拟合，获得二次多项回归方程如下。

Y=-10.53155+1.16627X₁+0.90409X₂+0.65017X₃+9.65×10³X₁X₂+4.5625×10⁴X₁X₃+0.01281X₂X₃-0.1509X₁²-0.15823X₂²-0.01478X₃ ²                        （1）

 式中，Y为GLYs累积量（mg·g^-1 DW），X₁为诱导时间（d），X₂为诱导质量浓度（g·100 mL⁻¹），X₃为培养温度（℃），回归系数R²=0.9254，表明模型拟合较好。   

 GLYs合成的优化条件为诱导时间4.03 d、诱导质量浓度4.08 g·100 mL^-1、培养温度23.83℃，此时GLYs累积量为1.4118 mg·g^-1 DW；对建立的模型进行方差分析（表4），F值为13.78（P=0.0002），表明模型适合度达到显著水平；响应面试验的误差较小（失拟项F=0.67，P=0.6650）；培养温度对GLYs合成累积量影响极显著，诱导时间和诱导浓度对GLYs合成累积量影响不显著；各因素间交互作用不显著；各因素对GLYs累积量的影响呈现二次曲线关系（P<0.001）；且培养温度对GLYs合成累积量的影响较大，其次为诱导质量浓度和诱导时间，综上所述，此模型可用于预测GLYs的合成累积量。

 本研究预测相关系数（Pred R²）和调整相关系数（Adj R²）分别为0.7069与0.8583，二者接近，显示GLYs的拟合过程有效；变异系数（CV）为11.02%，显示建立的模型具有较高的精确度与可信度；模型的信噪比为11.427（>4）,显示建立的模型有较高的精密度，由此表明，回归模型有良好的预测性；Design-Expert软件分析（图4）表明，残差的正态概率分布和预测值与实际值分布均处于一条直线，残差与预测值分布较为分散，显示拟合模型具有较好的适应性。

 由图5可知，当以培养温度为中心点时，GLYs累积量随着诱导时间从2～4 d先增加后降低；诱导质量浓度在2.0～4.0 g·100 mL⁻¹时明显增加，之后随着质量浓度的增加逐渐减少；曲线走势显示诱导质量浓度的3D曲面上升幅度比诱导时间的曲面上升稍明显（图5A），表明在研究诱导时间和诱导质量浓度交互效应时，诱导质量浓度对GLYs累积量影响更为明显；诱导质量浓度的等高线变化比诱导时间明显（图5B）；当以诱导时间为中心点时，培养温度的响应面3D曲面的升高幅度比诱导质量浓度的曲面上升幅度大（图5C）；培养温度的等高线变化比诱导质量浓度明显（图5D）；当以诱导质量浓度为中心点时，培养温度的响应面3D曲面的升高幅度比诱导质量时间的曲面上升幅度大（图5E）；培养温度的等高线变化比诱导时间明显（图5F），综上，培养温度对GLYs累积量影响显著。

（5）验证试验

 在XOS诱导质量浓度4.0 g·100 mL⁻¹与诱导时间3 d条件下，临沂产大粒黑豆诱导获得的GLYs累积量显著高于济宁产大粒与黑龙江产小粒黑豆（P<0.05），为了验证大豆抗毒素预测值的优化条件，在获得的优化条件（诱导时间4.03 d、诱导质量浓度4.08 g·100 mL⁻¹、培养温度23.83℃）下，选择临沂大粒黑豆材料开展验证工作；为满足验证试验的可操作性，验证条件设为诱导时间4 d、低聚木糖诱导质量浓度4 g·100 mL⁻¹、培养温度24℃。在3次重复试验中，GLYs诱导合成量达到1.3765 mg·g^-1 DW，与理论预测值1.4118 mg·g^-1 DW的相对误差为2.5%，表明响应面模型与实际合成量拟合良好，中心组合设计-响应面试验获得的模型有较好的预测性。

试验结论

 为研究大豆抗毒素（GLYs）合成的诱导条件，以低聚木糖（XOS）诱导黑豆合成的GLYs含量为考察目标，以XOS诱导质量浓度、诱导时间、培养温度为考察单因素，在此基础上采用中心组合设计-响应面法优化GLYs合成量的诱导条件，结果显示，建立的模型适合度显著（F=13.780），GLYs实际合成量与预测值拟合良好（R²=0.9254），优化后的最佳诱导条件为XOS诱导质量浓度4.0 g·100 mL^-1，培养温度24℃，诱导时间4 d，在此条件下，GLYs合成量为1.3765 mg·g^-1 DW，与预测值（1.4118 mg·g^-1 DW）相比，相对误差较小，培养温度对GLYs合成量影响极显著（P<0.05）；XOS诱导质量浓度和诱导时间对GLYs合成量影响不显著；三因素交互作用对GLYs合成量影响均不显著，由此表明，该方法合理可行，为大豆抗毒素制备及功能产品开发提供了理论依据。

参考资料：

王凯强,杨雪,李常风等.响应面法优化低聚木糖诱导大豆抗毒素合成条件[J].中国农业科技导报,2022,24(10):208-217.