试验设计

 将5周龄、体重18-20 g、无特定病原体的雄性C57BL/6J小鼠在室温（22±1℃）、湿度（55%±10%）的条件下进行饲养，光照/黑暗周期为12 h。将小鼠分为五组，喂食标准生长饲料和无菌水，实验设计见图1；适应性喂养1周后，将小鼠随机分为不同的实验组，除对照组外，所有小鼠均接受慢性温和不可预知应激（CUMS）方案，建立小鼠抑郁症模型，其余四组小鼠在研究过程中被给予不同剂量的XOS（0.23、0.50和1.0 g kg^-1 day^-1，溶于无菌水中），而后对小鼠进行行为测试，在所有测试之前，小鼠需在测试室中适应至少30分钟，在对下一只小鼠进行行为实验之前，需用70%的乙醇清洗测试设备，避免气味刺激。

 蔗糖偏好试验：在实验前，将小鼠提前在1%的蔗糖溶液（w/v）中适应48小时，剥夺食物和水24小时后进行12小时的蔗糖偏好试验，在实验中途调换两个瓶子的位置，记录试验前后瓶子的重量差，计算蔗糖偏好指数。

 旷场试验：实验装置包括一个白色的开放箱（40×40×35厘米），实验开始时，将每只小鼠放置在相同的位置，使用视频跟踪系统（EthoVision, Noldus Inc., Leesburg, VA, USA）记录并分析10分钟内小鼠在中心区域花费的总时间。

 高架十字迷宫试验：高架十字迷宫装置包含一个6×6厘米的中心广场，垂直放置，有两个封闭的和两个开放的手臂，每个长度为35厘米，距离地面60厘米，允许所有小鼠自由移动6分钟，并通过视频跟踪系统记录它们的运动，对进入的次数和在开放臂中花费的时间进行统计分析。

 强迫游泳试验：使用一个30厘米的玻璃缸，水温23-25℃，第一天，强迫所有小鼠游泳15分钟，以进行适应性训练；第二天，将小鼠放置在相同的环境中6分钟，如果它们只表现出一点点的努力来保持其头部在水面以上，则被认为是处于绝望状态，记录最后4分钟的绝望状态。

 悬尾试验：用胶布将小鼠的尾巴尖端（距尖端1厘米）固定在悬吊杆上（离地面30厘米），用视频跟踪系统监测运动活动，持续6分钟，记录静止时间。

 SCFAs浓度分析：将已知质量的粪便直接称量到无菌试管中，在500 μL饱和氯化钠溶液中浸泡30分钟，均质，然后用40 μL10%硫酸酸化，在酸化的匀浆中，加入1 mL乙醚，在4℃下以18000 g离心15分钟，将上清液从0.22 μm的有机相滤膜上移走，并小心地转移到气相小瓶中进行气相色谱-质谱分析。

 神经递质、色氨酸和色氨酸代谢物的测定：测定前额皮质（PFC）中血清素（5-HT）、5-羟色胺（5-HTP）和γ-氨基丁酸（GABA）的浓度及结肠中的色氨酸和色氨酸代谢产物、血清中的脑源性神经营养因子（BDNF）水平。

 粪便微生物群的16S rRNA扩增子测序：小鼠处死前将其粪便收集到无菌离心管中，进行16S rRNA扩增子测序，测定其肠道菌群的变化。

试验结果

（1）XOS对CUMS模型小鼠生长状况的影响

 如图1b所示，在CUMS过程中，CUMS模型组的体重变化持续低于对照组和XOS组；在整个实验过程中，在XOS的干预下，应激诱导小鼠的体重得到了改善。与CUMS模型组相比，三个剂量的XOS处理分别增加了57.8%、22.9%和39.0%的体重，图1c结果显示，低剂量的XOS干预可以显著改善应激诱导的体重下降（P<0.01）。

（2）XOS对小鼠抑郁症和焦虑样行为的影响

 通过SPT、TST和FST对抑郁相关行为进行评估，表明在整个实验过程中，4周的CUMS已经激发了小鼠的抑郁行为，模型组小鼠的蔗糖偏好指数下降（31.6%）。

 如图2a所示，用低、中、高剂量的XOS处理后，小鼠的蔗糖偏好指数分别增加了39.8%、34.4%和40.6%（P<0.05）；在TST和FST中，各种外部应激源明显增加了静止时间（增加了38.9%和35.2%）（P<0.05）；图2e和图2f结果显示，XOS处理显著降低了静止时间，特别是低、中剂量组在TST中分别降低了26.9%和34.6%（P<0.05），在FST中降低了29.3%和25.6%（P<0.01）。

 如图2b、图2c所示，与对照组相比，模型组小鼠进入中央区域的时间明显减少（28.4%），进入张开臂区域的时间显著减少（39.8%）（P<0.05）；XOS的干预改善了探索活动，然而，只有中剂量组显示出显著的差异（P<0.05）；图2d结果显示，所有的XOS处理组在张开臂上花费的时间增加，但没有显著性差异。

（3）XOS对大脑神经递质的影响

 如图3所示，服用XOS后，小鼠的神经递质得到改善，尤其是0.23 g kg^-1 day^-1的XOS实验组。图3a和图3b结果显示，慢性应激引起的前额皮层（PFC）5-HT和5-HTP的分泌显著增加7%和5%（P<0.05）；图3c显示，与模型组相比，低剂量的XOS处理增加了PFC中的GABA水平（7%）（P<0.05）；图3d显示，对血清中BDNF的水平进行了评估，结果显示，暴露于慢性应激后，血清中BDNF的浓度显著下降（P<0.05），低剂量XOS干预提高了BDNF水平，但与模型组相比没有显著差异。

（4）XOS对色氨酸和色氨酸代谢物的影响

如图4所示，不同剂量的XOS干预对应激小鼠的Trp变化有相同的影响；在XOS的干预下，色氨酸（Trp）和犬尿喹啉（Kyn）的浓度都有所增加，特别是在XOS的剂量为0.23 g kg^-1 day^-1时，Trp和犬尿喹啉（Kyn）的浓度分别增加了53%（P<0.05）和202%（P<0.01）。

（5）XOS对SCFA的影响

 如图5所示，对照组和模型组中SCFAs的浓度非常相似，表明4周的慢性应激不足以引起SCFAs含量的变化，摄入XOS后，粪便中SCFAs的含量有显著增加，说明饮食中补充XOS可以增强SCFAs的产生；在对照组小鼠中，乙酸盐（39.33±3.31 μmol g^-1）是最主要的SCFAs类型，占小鼠肠道细菌产生的SCFAs比例最高，其次是丙酸盐（11.37±1.38 μmol g^-1）、丁酸盐（7.84±0.91 μmol g^-1）和戊酸盐（6.00±0.70 μmol g^-1）；与模型组相比，低和中剂量组小鼠粪便中的乙酸盐水平分别显著增加91%和55%（P<0.01）；给予0.23 g kg^-1 day^-1的XOS，丙酸盐和丁酸盐的水平显著增加81%和83%（P<0.01），中等剂量的XOS，丙酸盐的水平也增加51%（P<0.05），但它没有改变粪便中戊酸盐的水平（P>0.05）。

（6）XOS对肠道微生物群组成的影响

 如图6所示，小鼠中最主要的门类仍然是厚壁菌门和拟杆菌门。图6a显示，在暴露于应激和XOS干预后，每组的相对丰度仅有轻微变化，然而，在CUMS的刺激下，一些细菌有明显的变化，例如，Verrucomicrobiota和Actinobacteria的相对丰度比对照组低，XOS干预显著增加了应激小鼠中Verrucomicrobiota和Actinobacteria的丰度。

 如图6b所示，Chao 1指数和Shannon指数之间没有统计学差异，此外，β多样性的分析显示，模型组的微生物群与XOS处理组的微生物群有明显的区别，表明在饮食中补充XOS后，粪便微生物群的组成发生了改变，说明XOS处理可以使慢性应激引起的肠道微生物群的改变正常化。Lefse（线性判别分析效应量，LDA效应量）分析表明，模型组中Deferribacterota、Deferribacteraceae、Desulfovibrio、Deferribacterales、Deferribacteres和Mucispirillum的相对丰度显著增加；图6c结果显示，在高剂量XOS处理的小鼠中，Eggerthellaceae、Enterorhabdus、Coriobacteriales、Coriobacteriia、Prevotellaceae和Prevotellaceae_UCG_001的相对丰度得到改善；图6d显示，在属水平的五个组中，有五个高度不同的相对丰度，包括Muribaculaceae_norank、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Akkermansia和Clostridia_UCG014_norank。

 如图7所示，与对照组相比，模型组的Akkermansia的相对丰度明显下降（P<0.05），在0.50 g kg^-1 day^-1 XOS的干预下，其相对丰度增加（226%）；与模型组相比，脱硫弧菌的相对丰度显著增加（P<0.05），而XOS的干预缓解了慢性应激引起的相对丰度的增加；在丁酸盐产生菌中，Roseburia（P<0.05）和Eubacterium_xylanophilum_group（P<0.01）在0.50 g kg^-1 day^-1 XOS的干预下可以显著增加，此外，肠道有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌的相对丰度也显著增加（P<0.05）。

试验结论

 本研究基于慢性温和不可预知应激诱发的抑郁症小鼠模型为研究对象，探究不同剂量的XOS对情绪和行为的调节作用，结果显示0.23和0.50 g kg^-1 day^-1剂量的XOS能够显著提高悬尾和强迫游泳试验中的蔗糖偏好指数，并降低了静止时间；同时0.23 g kg^-1 day^-1剂量的XOS能够显著增加神经递质的浓度，如5-羟色胺和γ-氨基丁酸；此外，对XOS干预下的粪便微生物群的分析显示，阿克曼氏菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的相对丰度较高，脱硫弧菌属较少，且SCFA浓度显著增加。以上结果表明膳食补充XOS可以通过调节神经递质和逆转小鼠肠道微生物群的变化来改善慢性应激引起的抑郁样行为，表明XOS是一种潜在的靶向肠道微生物群的益生元，可用于改善情绪障碍。

参考资料：

Shu X , Tong Y , Yang R .Administration of xylo‐oligosaccharides improves depressive‐like behaviour in mice caused by chronic unpredictable mild stress by altering microbiota composition[J].International Journal of Food Science and Technology, 2022, 57(7):4222-4233.