低聚糖：低聚异麦芽糖（IMO）；棉子糖；低聚木糖（XOS）；菊粉；低聚果糖；甘露寡糖（MOS）；乳果糖；D-纤维二糖；菌株：植物乳杆菌菌株（ZS2058、T和ST-III）、鼠李糖乳杆菌GG（LGG）和鼠伤寒沙门氏菌SL1344（SL1344）。
测定乳酸菌在低聚糖补充的培养基中的生长情况：将低聚糖或葡萄糖添加到无葡萄糖的MRS培养基中，最终浓度为20 g/L；将过夜的乳酸菌（0.1毫升）接种到这些培养基中，并在37℃下培养36小时，使用分光光度计每2小时测量一次OD600值，持续36小时（n=3），比较不同培养基中植物乳杆菌ZS2058的最终OD600值（以平均值±标准误差表示），不同上标字母的数值有显著差异，P＜0.05。 动物实验设计：选择6-7周龄、无特异性病原体（SPF）的C57BL/6雌性小鼠为研究对象，在温度22±2℃，湿度55±5%的环境下进行饲养，光照/黑暗周期为12 h。本研究中包括三个动物实验（图1），实验方案如下： 实验1：将135只小鼠分为9组（n=15），对照组和模型组接受常规饮食，每天灌胃0.1 mL PBS；ZS2058组接受常规饮食，每天灌胃0.1 mL PBS-重悬的植物乳杆菌ZS2058（5.0×109 CFU/mL）；其他组接受低聚糖或葡萄糖补充的饮食（1% w/w），并每天灌胃L. plantarum ZS2058，预处理10天后，小鼠（除对照组外）通过灌胃感染S. Typhimurium SL1344（1.0×106 CFU），并在感染后18天内监测存活率。 实验2：将另外150只小鼠分为15组（n=10），其中9组按上述方法处理，余下6组接受低聚糖或葡萄糖补充饮食（1% w/w），每天灌胃0.1 mL PBS，预处理10天后，收集小鼠粪便，用S. Typhimurium SL1344（1.0×106 CFU）感染小鼠（对照组除外），并监测其存活率。 实验3：将25只小鼠分为5组（n=5），分别为对照组、模型组、ZS2058组、XOS组和XOS+ZS2058组，均如上所述进行预处理，预处理10天后，使小鼠（除对照组外）感染沙门氏菌，感染后的小鼠在2 DPI时在二氧化碳安乐死系统中实施安乐死，收集血清、盲肠内容物和肝脏，并在-80℃下保存，直到使用。
低聚糖对植物乳杆菌ZS2058的拮抗活性的影响：在pH值为7.2的BHI培养基中加入低聚糖或葡萄糖（2 g/L），将乳酸菌和鼠伤寒沙门氏菌SL1344的过夜培养物洗净并重新悬浮在0.1 M PBS（pH6.2）中，将100 μL PBS中的约1.0×108个CFU细菌接种到不同的培养基中，并在37℃培养18小时，然后用PBS连续稀释共培养物的悬浮液，并在补充有链霉素的LB琼脂上镀上浓度为50 μg/mL的链霉素，对沙门氏菌的CFUs进行计数和记录。 粪便中SCFAs浓度的测定：收集小鼠粪便，冷冻干燥后进行称重，随后，将粪便浸泡在饱和氯化钠中，用硫酸水溶液和二乙醚分别进行酸化和提取处理，检测SCFAs浓度。 细胞因子的测定：将新鲜肝脏在放射免疫沉淀试验（RIPA）裂解缓冲液中以1：10（m/v）的稀释度匀浆，然后用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测这些匀浆中各种细胞因子、组织坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的水平。 16S rDNA测序和生物信息学分析：从小鼠粪便内容物中提取并纯化微生物DNA，然后通过PCR扩增16S rDNA的V4区，经过琼脂糖凝胶电泳、用QIA快速凝胶提取试剂盒进行凝胶提取、定量和文库制备后进行测序。 试验结果 （1）低聚糖对植物乳杆菌生长的不同影响 如图2A-E所示，与普通MRS培养基相比，在FOS、乳果糖和D-纤维二糖补充的培养基中生长的植物乳杆菌菌株表现出相似的快速生长，最终OD600值很高；植物乳杆菌菌株，特别是ZS2058和ST-III，在棉子糖补充的培养基中生长得更慢；图2F-I显示在IMO、MOS、菊粉和XOS补充的培养基中，所有测试菌株的OD600值都低很多，以上表明不同的低聚糖对L. plantarum ZS2058的生长有不同的影响。
（2）XOS促进了植物乳杆菌ZS2058对沙门氏菌感染的预防作用 如图3A、图3B所示，用低聚糖和植物乳杆菌ZS2058处理并没有引起感染小鼠体重和饮食摄入量的显著变化；图4A显示，在感染后18天（DPI），发现只有XOS能显著提高ZS2058处理小鼠的存活率（66.7% vs. 53.3%），而其他低聚糖会降低存活率（FOS：46.7%；棉子糖：26.7%；MOS：26.7%；菊粉：40%）；图4B显示，接受XOS补充饮食的小鼠在18 DPI时的存活率与模型组相同，而XOS+ZS2058组则增加了38%，其他低聚糖或其与植物乳杆菌ZS2058的组合并没有比ZS2058组表现更好，以上结果表明XOS促进了植物乳杆菌ZS2058对沙门氏菌感染的预防作用，而不是发挥了协同作用。
（3）在体外共培养体系中，XOS能显著提高植物乳杆菌ZS2058对沙门氏菌的拮抗活性 由表2可知，在BHI培养基中，鼠伤寒沙门氏菌SL1344的细胞密度在培养24小时后达到12.73×108 CFU/mL，它的生长被XOS（5.20×108 CFU/mL）、乳果糖（7.67×108 CFU/mL）和D-纤维二糖（9.20×108 CFU/mL）显著抑制，相反棉子糖显著增加了鼠伤寒沙门氏菌SL1344的生长，而菊粉、FOS、MOS和IMO没有显示出明显的影响。植物乳杆菌ZS2058显示出拮抗活性，将鼠伤寒沙门氏菌SL1344的细胞密度从12.73×108 CFU/mL降低到10.73×108 CFU/mL，在共培养系统中补充XOS进一步降低了沙门氏菌的细菌数量，使其达到更低的水平（1.01×108 CFU/mL），这一结果表明，在体外共培养体系中，XOS显著促进了植物乳杆菌ZS2058对沙门氏菌的拮抗活性，这可能有助于增强植物乳杆菌ZS2058的抗沙门氏菌活性，除棉子糖以外的低聚糖，也促进了植物乳杆菌ZS2058的拮抗活性，但图1A和图1B的体内实验结果显示，植物乳杆菌ZS2058的益生菌作用没有被这些低聚糖所促进。
（4）XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合显著增加了粪便中SCFAs的含量 如图5A、图5B所示，经XOS处理的小鼠乙酸和丙酸的含量有轻微但不显著的增加；图5A-C显示，XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合显著增加了乙酸、丙酸和丁酸的水平，且其他低聚糖和它们与植物乳杆菌ZS2058的组合并没有引起任何测试的SCFAs的显著变化，以上结果表明，尽管SCFAs的含量不受植物乳杆菌ZS2058或低聚糖预处理的影响，但XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合显著增加了SCFAs的产生。
（5）XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合恢复了肝脏中的炎症反应 如图6所示，感染小鼠（模型）的IL-6、TNF-α和IL-1β的水平都有所下降，但XOS和植物乳杆菌ZS2058（XOS+ZS2058）的组合则显著增加，且发现沙门氏菌也可以减少促炎细胞因子的产生，抑制促炎性细胞因子也可能有助于病原体逃避宿主的免疫监视，实现全身感染。XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合显著增加了IL-6、TNF-α和IL-1β的产生；对于植物乳杆菌ZS2058处理的小鼠，这些促炎细胞因子的水平与模型组相当，而XOS处理只增加TNF-α的水平，以上结果表明肝脏中的炎症反应被沙门氏菌所抑制，并通过XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合得到恢复。
（6）XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合通过靶向特定的细菌来改变肠道微生物群 如图7A所示，在基因组比对和注释后，主成分分析（PCA）显示，XOS、植物乳杆菌 ZS2058和它们的组合将肠道微生物群重新编程为不同的轮廓，进一步分析菌属水平的相对丰度，表明沙门氏菌感染改变了肠道微生物群的结构。 如图7B显示，XOS、植物乳杆菌 ZS2058和它们的组合对细菌的相对丰度产生了不同的影响；图7C显示，Sutterella、Bilophila和f_Peptostreptococcaceae_g是代表肠道微生物群变化的最佳候选细菌，感染小鼠中Sutterella和Bilophila的相对丰度显著降低，XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合使这些细菌的相对丰度恢复到与对照小鼠相当的水平。 如表3可知，f_Peptostreptococcaceae_g（属于Peptostreptococcaceae的一个属）细菌在受感染的小鼠中从0.1428%增加到0.2504%，并植物乳杆菌ZS2058和XOS处理后分别增加到1.2957%和0.3671%，用XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合处理，将其相对丰度降低到0.1020%（表3）。 如图7D显示，不同的处理方法使肠道微生物群在不同的类群（门到属）发生了显著的变化，Deferribacteres（门）、Deferribacteres（类）、Deferribacterales（目）、Deferribacteraceae（科）和Mucispirillum（属）被确定为用XOS和植物乳杆菌ZS2058联合处理的小鼠的标记菌，Mucispirillum属属于其他四个分类群，因此，Mucispirillum可以作为XOS和植物乳杆菌 ZS2058组合改变肠道微生物群的一个特殊目标。
试验结论 本文研究低聚糖的膳食补充和它们对植物乳杆菌ZS2058抗沙门氏菌活性的影响，结果表明在所研究的五种低聚糖中，只有低聚木糖（XOS）能显著提高植物乳杆菌ZS2058处理的鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的存活率；在体外共培养系统中，XOS显著促进了植物乳杆菌ZS2058对沙门氏菌的拮抗活性（增加92%）；XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合显著增加了沙门氏菌感染的小鼠粪便中的短链脂肪酸（SCFAs）含量，且XOS、植物乳杆菌ZS2058及其组合使肠道菌群呈现出明显的分布特征。以上结果表明低剂量的XOS和植物乳杆菌ZS2058的组合对预防沙门氏菌感染有很大的潜力。 参考资料： Wei Z H J W S F X J L .Dietary supplementation with low-dose xylooligosaccharide promotes the anti-Salmonella activity of probiotic Lactiplantibacillus plantarum ZS2058 in a murine model[J].Food Research International,2022. |
