试验设计 选择48只雄性Wistar大鼠（6周龄，200-250克），大鼠被单独安置在标准的笼子里，在12/12的光照/黑暗循环室内，温度控制在25℃，适应1周后，所有大鼠被随机分为两组，分别饲喂正常饮食（ND）或高脂饮食（HFD）24周；ND的脂肪能量为19.77%，而HFD的脂肪能量增加到59.28%；第13周时，各组随机分为4个亚组进行特殊处理，每个亚组的大鼠（n=6/亚组）通过灌胃管口服载体（PBS；1 mL/d）、益生菌（L. paracasei HII01 1×108 CFU/mL/d；1 mL/d）、益生元（10% XOS；1 mL/d）或合生元（益生菌和益生元1：1的组合；2 mL/d），再持续12周；分别在第0、12和24周采集血样，在实验结束时进行安乐死之前，给每只大鼠注射钙黄素溶液（10毫克/千克）两次（即间隔6天），收集下颌骨并通过骨组织形态学进行分析（见图1中的实验设计图）。
代谢参数和全身炎症的测定：在基线、第12周和第24周记录代谢参数，其中包括体重、内脏脂肪重量、血浆脂质概况、血浆葡萄糖和血浆胰岛素水平，且在每个时间点，在从尾静脉采集血液之前，大鼠饥饿了至少5小时。对于胰岛素敏感性，在研究的第24周的第一天进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），大鼠禁食12小时，在用灌胃管口服葡萄糖（2克/公斤体重）前采血，并在喂食葡萄糖0、15、30、60和120分钟后及时采血，进行上述葡萄糖分析，并对血清脂多糖（LPS）水平进行量化，以表明代谢性内毒素血症或系统性炎症。 胰岛素抵抗评估：胰岛素抵抗是通过平衡模型评估（HOMA）确定的，HOMA指数由以下公式计算，HOMA指数越高，表明胰岛素抵抗水平越高。
骨组织形态学微结构分析：将没有粘附结缔组织的右半颌骨在70、95和100% v/v系列的乙醇中各浸泡3天。然后，将脱水的骨骼样本安装在甲基丙烯酸甲酯树脂中。用装有碳化钨刀片的旋转切片机对树脂包埋的骨骼进行切割，厚度分别为7 µm和12 µm，用于静态和动态研究；然后将骨片安装和处理，以便在显微镜下观察；下颌骨的具体关注区域来自第二臼齿区的正面切片。静态组织形态学评估：在早期指定的下第二磨牙的齿间区域，对7微米的切片进行Goldner三色染色处理，并在光学显微镜下观察（图2）。对于动态组织形态测量技术，使用12微米的未染色切片，在光/荧光显微镜下观察钙黄素标记的双线，获得的参数包括矿物附着率（MAR，µm/day）和骨形成率（BFR，µm3 µm-2 day-1）。
试验结果 （1）益生菌L. paracasei HII01、益生元XOS和合生元处理减轻了肥胖-胰岛素抵抗和全身性炎症 由表1可知，HFD喂养的大鼠在12周的饮食挑战后变为肥胖-胰岛素抵抗，这表现为体重和血浆脂质的升高。观察到血浆胰岛素的增加，而血浆葡萄糖水平没有任何显著的差异；通过血清LPS水平的升高，观察到HFD组发生了"代谢性内毒素血症"。
由表2可知，在第24周，载体处理的HFD组继续出现肥胖-胰岛素抵抗，并显示出代谢性内毒素血症的证据；与载体处理的HFD（HFV）组相比，用益生菌L. paracasei HII01、益生元XOS和合生元干预12周后，体重、内脏脂肪、血浆胆固醇、血浆胰岛素水平、HOMA指数和OGTT曲线下面积基本上都有所下降，这些发现表明，所有的生物制剂处理都同样地降低了肥胖-胰岛素抵抗和系统性炎症。
（2）益生菌、益生元和合生元增强了下颌骨骨小梁的厚度 如图3所示，从静态骨组织形态学来看，高脂饮食24周导致下颌骨骨小梁厚度减少，而骨体积分数、骨小梁分离度或骨小梁数量无显著变化，且所有的生物补充剂都能恢复HFD喂养大鼠的骨小梁厚度。
（3）补充益生菌、益生元和合生元后，破骨细胞介导的骨吸收降低 如图4a所示，24周后两种饮食之间的成骨细胞表面无显著差异；图4b显示，与ND大鼠相比，HFV组的破骨细胞表面明显增加；图4c显示，在HFD喂养的大鼠颌骨中，代表破骨细胞的蛋白溶解活性的持续活性侵蚀面也在扩大；图4b和图4c显示，与载体处理的HFD大鼠相比，用益生菌、益生元和合生元处理的大鼠显示了较低的破骨细胞和活性侵蚀面。这些发现表明，在HFD喂养的大鼠中，所有的处理都同样减少了破骨细胞介导的颌骨骨吸收，但对成骨细胞相关的静态骨组织形态无显著影响。
（4）益生菌、益生元和合生元恢复了HFD喂养大鼠的矿物质附着和骨形成率 如图5a所示，用钙黄素标记的双绿色荧光线代表新的矿化区，表明食用HFD 24周后，颌骨的矿化附着率和按骨面归一化的骨形成率显著下降，证明HFD确实损害了骨形成，尽管成骨细胞表面没有变化；图5b和图5c显示，在HFD喂养组，所有的处理都显著增加了这两个动态参数。
试验结论 本研究通过骨组织形态分析证实了益生菌L. paracasei HII01、益生元XOS以及它们的组合（一种合生元）对大鼠颌骨微结构的影响，以及对HFD诱导的肥胖-胰岛素抵抗大鼠代谢和炎症的影响，结果表明，每日口服益生菌L.paracasei HII01、益生元XOS或两者作为合生元，持续12周，对减轻肥胖-胰岛素抵抗和减少系统性炎症有相同的影响，并对改善HFD喂养大鼠的颌骨微结构有类似的潜在积极作用。 参考资料： Eaimworawuthikul, S., Tunapong, W., Chunchai, T. et al. Altered gut microbiota ameliorates bone pathology in the mandible of obese–insulin-resistant rats. Eur J Nutr 59, 1453– 1462 (2020). |
