试验目的

本实验利用荧光定量PCR技术，探讨了投喂低聚木糖对草鱼免疫相关基因IL-1β、IFN以及TNF-α表达的影响，为今后的深入研究提供有利参考。

试验设计

取规格基本一致的18 g健康草鱼共315尾，随机分为3组，每组设3个重复。对照组投喂基础饲料设为A0组，试验组在基础饲料中分别添加2 g/kg(A2组)和4 g/kg(A4组)的低聚木糖，驯养15d后开始正式试验，试验共进行56 d。低聚木糖纯度95%。基础饲料配方及营养水平同表1。

分别在试验开始后第14 d、第28 d、第42 d和第56 d解剖鱼(每组5尾)，取肝脏、肾脏、脾脏组织块约50或100 mg，用0.1% DEPC处理过的水冲洗掉表面的血迹，用无菌纱布吸干后，迅速匀浆并用Trizol(TaKaRa)提取组织的总RNA。或将组织样迅速放入液氮中保存备用。

提取RNA后，用紫外分光光度计测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。按1OD=40 μg RNA计算RNA的质量，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0视为抽提的RNA的纯度较高。

参照逆转录酶的标准反应体系进行试验。反应液配制均在冰上进行。

采用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，引物所扩增的目的片段小于500bp，引物设计所依据的基因模板序列均来源于NCBI DNA数据库。本实验设计的引物见表2。

试验结果

（1）低聚木糖对IL-1β表达的影响

 检测肝脏中IL-1β表达水平，发现在试验开始后第14 d，与对照组相比，A4组IL-1β表达显著下调(P<0.05)，第28 d，A2和A4组表达均显著下调(P<0.05)，分别是对照组的0.17和0.18倍。第42-56 d，IL-1β表达均上调，但A2组差异不显著，A4组差异显著(P<0.05)，分别是对照组的1.70和1.55倍。详见图1。

 检测肾脏中IL-1β的表达变化，结果表明，在整个试验期间，A2和A4组IL-1β表达均上调，在第14-28 d差异显著(P<0.05)，且在第14 d达到最高，分别是对照组的10.18和10.94倍。详见图2。

 检测脾脏中IL-1β的表达结果发现，A2组从第14 d开始，IL-1β表达上调，且与对照组相比差异显著(P<0.05)，在第14 d表达水平最高为对照组的6.63倍。而A4组从第28 d开始表达上调且差异显著(P<0.05)。详见图3。

（2）低聚木糖对IFN表达的影响

 检测肝脏中IFN的表达水平，结果显示，在试验开始后第14-28 d，与对照组相比，A2和A4组IFN表达均显著下调(P<0.05)，第42-56 d，表达均上调，但A2组与对照组相比差异不显著，A4组差异显著(P<0.05)，分别是对照组的1.55和1.50倍。详见图4。

 检测肾脏中IFN表达水平，A2组表现为先下调后上调，第28 d表达量显著提高(P<0.05)，是对照组的1.64倍。A4组在第14-28 d表达显著下调(P<0.05)，第42-56 d表达上调，在第42 d差异显著(P<0.05)，IFN表达量是对照组的1.92倍。详见图5。

 检测脾脏中IFN表达水平，结果发现，试验期间，A2组IFN表达与对照组相比，在第56 d显著下调(P<0.05)。A4组表达一直上调，第28-56 d表达水平显著提高(P<0.05)，分别是对照组的12.16、6.22和1.47倍。详见图6。

（3）低聚木糖对TNF-α表达的影响

 检测肝脏中TNF-α的表达水平，结果显示，在试验开始后第14 d，A2组TNF-α表达显著下调(P<0.05)，是对照组的0.83倍。第28-56 d，A2和A4组TNF-α表达均上调，且A4组差异显著(P<0.05)，而A2组在第42 d显著上调(P<0.05)。A2和A4组TNF-α表达量均在第42 d达到最高水平，分别是对照组的9.55和10.68倍。详见图7。

 检测肾脏中TNF-α的表达水平发现，A2和A4组TNF-α的表达均表现为先上升后抑制，再有上升。在第14 d，A2和A4组TNF-α的表达显著上调，分别是对照组的1.71和1.55倍，第28d，两组表达显著下调，分别是对照组的0.15和0.14倍。之后TNF-α的表达上调至与对照组相当水平。详见图8。

 检测脾脏中TNF-α的表达量发现，在试验的第28 d，A2和A4组TNF-α表达极显著上调(P<0.05)，分别是对照组的10.53和14.74倍。A4组在第42 d仍表现为显著上调(P<0.05)，是对照组的1.72倍。详见图9。

试验结论

 本研究中低聚木糖能使草鱼IL-1β、IFN以及TNF-α基因的表达显著上调，表明低聚木糖有利于机体清除细菌性病原以及抗病毒感染，并通过促进免疫因子的表达来提高机体特异性和非特异性免疫，从而增强鱼体抗病力。

参考文献：

庞丽姣.低聚木糖对草鱼非特异性免疫功能及免疫相关基因表达的影响[D].华中农业大学,2011.