试验设计 动物和饮食干预：选择30只10周龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重380-420克，所有的大鼠都被饲养在一个有12小时光照和黑暗周期的空调房间里。在所有的实验开始之前，大鼠被禁食24小时。经过一周的适应期后，大鼠被随机分为五组（n=6），饲喂标准饮食或高脂饮食：正常饮食（CON）、高脂饮食（HF）和高脂饮食喂养的大鼠用0.4 mL XOS （2 g/mL溶解于PBS）（XOS）、正长生菌株（CMCC63516，由东北制药集团沈阳第一制药有限公司分离培养，中国，Lot S10950019）以7.5×108个CFU/mL悬浮在PBS中（BL），或XOS和BL联合补充（XOS-BL）处理。对照组大鼠被喂食正常饮食；其他组被喂食高脂饮食（60%脂肪，20%蛋白质，20%碳水化合物，占总热量的百分比，H10060，北京HFK生物科学有限公司）。XOS、BL和XOS-BL组每天灌服1次0.4毫升的XOS、BL和XOS-BL，持续三周。CON组和HF组则用0.4毫升PBS灌胃。每周评估一次体重增加和其他参数。在3周后收集粪便进行16S rRNA测序。3周后，对大鼠进行安乐死以收集血液和组织。对附睾脂肪和肾周脂肪进行称重，并计算附睾脂肪和肾周脂肪与体重的比值。 生化分析：从心脏采集血样，在25℃下以3,000 rpm的速度分离出血浆，然后在-80℃下储存待用。将肝脏组织与生理盐水按1：9的比例混合并匀浆。混合物在4℃下以12,000 rpm离心10分钟，然后保留上清液用于后续分析。根据相关检测试剂盒的说明，用酶法检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的浓度（南京建城生物技术研究所，中国南京）。血清和肝脏中的LPS水平用ELISA试剂盒检测（上海冷顿生物科学有限公司，中国上海）。 变性梯度凝胶电泳（DGGE）：使用QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）提取粪便DNA。使用通用细菌引物F338+GC钳和R518进行PCR扩增，该引物针对16S rRNA基因的高变异V3区。使用Bio-Rad公司（Hercules, CA, USA）的DCode系统对所得的16S rDNA扩增子进行DGGE指纹分析；用Quantity One图像分析软件（4.6.1版；Bio-Rad）对DGGE图像进行分析。相似性以树状图的形式显示。 Illumina HiSeq测序和生物信息学分析：使用通用引物（520F，802R）扩增五组大鼠粪便中元基因组DNA的16S核糖体DNA的V3-V4区（每组n=5-6）。PCR产物经1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳在0.5 mg/mL溴化乙锭中检查并纯化。在Novogene（中国北京）的Illumina HiSeq平台上进行测序。在50%以上的粪便样本中出现的操作分类单位（OTU）被确定为核心OTU。根据OTU的结果，对α和β多样性进行分析。α多样性由观察到的物种和香农指数进行评估。群落丰富度由Chao1指数评估。β多样性通过主坐标分析（PCoA）评估，基于加权的UniFrac分析和非加权对群法与算术平均聚类（UPGMA）。线性判别分析效应大小（LEfSe）被用来识别不同分类水平的组间有差异的细菌类群。线性判别分析（LDA）被用来估计每个不同丰度特征的效果大小。 试验结果 （1）BL联合XOS对HFD喂养大鼠体重、脂质参数和炎症标志物的影响 如图1（a）和1（b）所示，与对照组相比，HFD在第6天后诱导了最终体重和体重增加的显著升高（P<0.0001）；图1（b）显示，BL和XOS的联合补充（XOS-BL）降低了这种增加的趋势（P=0.0588），3周后，联合补充BL和XOS显著降低了HFD喂养大鼠的体重增加（P=0.0323）；然而，图1（c）和1（d）显示，各组之间在附睾和肾周脂肪垫的总重量上无显著差异；图2（a）和2（c）显示，与HF组相比，XOS-BL组的血清TC和LDL-C水平显著下降（分别为P=0.0027和P<0.0001）；图2（b）和2（d）显示，与HF组相比，XOS-BL组的TG水平呈下降趋势，而HDL-C水平呈上升趋势；此外，还评估了BL和XOS对肥胖大鼠的抗炎能力；图2（e）显示，与HF组相比，我们观察到XOS-BL组的血清LPS水平显著下降，表明内毒素血症和系统性慢性炎症的缓解（P=0.0346）；在BL和/或XOS处理后，还对大鼠肝脏的LPS水平进行了评估；图2（f）显示，与HF组相比，BL组的肝脏LPS显著降低（P=0.049）。这些结果说明，联合补充BL和益生元XOS可以有效地改善肥胖大鼠的体重和血清参数。
（2）联合BL和XOS对HFD大鼠肠道菌群的影响 如图3（a）所示，对照组和HF组大鼠肠道微生物丰度有显著差异；基于DGGE图谱构建的树状图支持它们加入到不同的聚类；图3（b）显示，HF组和BL组在一起，而XOS组和XOS-BL组在一个簇中；在图3（a）中，选择了23条在各组间有明显差异的条带，并将其切除进行测序分析；为验证DGGE的分辨能力，对相同位置但不同通道的条带进行切割和测序。测序结果表明，它们属于同一菌群，汇总于表1。CON组的微生物群的特点是存在乳酸菌属（条带1和3）；Phascolarctobacterium succinatutens（条带5）和Bacteroides uniformis（条带6和7）在高脂饮食组中被确认；XOS和XOS-BL组表现出与P. succinatutens相对应的强烈条带；在CON、XOS和XOS-BL组中分别检测到与Prevotella copri（条带2和11）相对应的条带；XOS和BL组的模式显示了对应于Parabacteroides distasonis的条带，特别的是，在XOS组中发现了对应于假长双歧杆菌的条带23。
如图4所示，对16S rRNA基因序列的V3-V4区进行宏基因组分析，在抽样后，1,124个操作分类单位（OTU）以97%的相似度被分类；图4（a）显示，对照组的OTU数量为908，远远高于其他组，其中，对照组有156个OTU，HF组有39个OTU，而XOS组、BL组和XOS-BL组分别有14个、22个和18个OTU；图4（b）-4（d）显示，α多样性分析显著，各组间差异显著，表明高脂饮食及给予BL和XOS显著改变了肠道菌群的多样性和丰富度；图4（e）和4（f）显示，各组肠道微生物群组成存在明显的聚类（对照组与HF，R=0.615，P=0.001；HF与XOS，R=0.441，P=0.001；HF与BL，R=0.075，P=0.606；HF与XOS-BL，R=0.454，P=0.001），表明XOS-BL的摄入方式对HFD喂养大鼠的肠道微生物群组成有一定影响。  如图5（a）所示，本研究中SD大鼠粪便菌群主要有三个门：拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门；厚壁菌门与拟杆菌门的比值（F/B），广泛用于肠道生态失调的标志，图5（b）显示，与HF组相比，XOS-BL组的F/B值显著较低（P<0.01）。我们的研究结果表明，导致厚壁菌门和拟杆菌门变化的主要分类群是拟杆菌属和乳酸菌属。与HFD组相比，CON组大鼠的总乳酸杆菌丰度显著较高（+19.7%，P<0.01）；图5（c）显示，在XOS-BL组中，普雷沃特氏菌科和粪拟杆菌的丰度不同（P<0.01）；图5（d）和5（e）显示，产生SCFA的Parabacteroides属（拟杆菌的成员）和Blautia属（厚壁菌门的成员）是XOS组小鼠的关键分类群，进一步检验科、属和种层面的统计学差异；图6（a）显示，在科水平上，在XOS和BL的补充下，Prevotellaceae显著升高，而Ruminococcaceae、Desulfovibrionaceae和未识别的梭菌科（Clostridiales）显著减少；图6（b）显示，在属水平上，XOS和BL处理改变了3个代表性属。在XOS和BL处理后，厌氧菌显著增加，而未识别的梭菌和Tyzzerella显著减少；图6（c）显示，在物种水平上，有2个物种被XOS和BL处理改变，XOS联合BL干预均能显著降低单形拟杆菌和细菌YE57。
（3）各组生物标记物 如图7所示，采用宏基因组分析LEfSe方法确定了导致类群差异的关键系统类型。LDA评分图显示了各组中的优势细菌（LDA>4）；乳酸菌科在对照组大鼠中最多，而 Desulfovibrionaceae，Rikenellaceae和 Ruminococcaceae在HFD喂养大鼠中最多。在XOS处理的大鼠中，双歧杆菌科和Erysipelotrichaceae最为丰富；在BL处理的大鼠中，拟杆菌科最为丰富；而在XOS+BL处理的大鼠中，普雷沃氏菌科最为丰富。这些细菌是造成不同组的肠道微生物群差异的主要系统类型，此外，这一结果与图3和表1中DGGE的结果一致。
（4）LPS水平与微生物类群的关系 如图8（a）所示，Mantel检验和典型相关分析（CCA）表明，血清和肝脏的LPS水平是造成细菌群落和环境因素之间差异的主要因素（P=0.005）；图8（b）显示，本研究通过Spearman算法评估了肠道微生物群组成和LPS水平之间的相关性，一些肠道微生物的丰度，包括乳酸杆菌、未识别的Ruminococcaceae，Roseburia和Butyrivibrio与血清和肝脏的LPS水平呈正相关；相比之下，Blautia，Flavonifractor，双歧杆菌, Parabacteroides，Lachnoclostridium，Erysipelatoclostridium和Staphylococcus与血清和肝脏LPS水平呈负相关。
试验结论 本研究表明，联合补充BL和XOS可以抑制高脂饮食引起的F/B比值的上升，以及Desulfovibrionaceae和Ruminococcaceae丰度的升高和LPS水平的升高。这些结果表明，将地衣芽孢杆菌和益生元XOS结合起来作为一种饮食干预策略，可以改善肠道失调，改善炎症状态，从而减少与HFD诱导的肥胖相关疾病。 参考资料： Yuyuan L ,Man L ,He L , et al.Oral Supplements of Combined Bacillus licheniformis Zhengchangsheng® and Xylooligosaccharides Improve High-Fat Diet-Induced Obesity and Modulate the Gut Microbiota in Rats.[J].BioMed research international,2020,20209067821. |
