试验设计

 菌泥产生、收集及冻干的工艺流程图如下：

测定指标为冻干存活率（R1）和单位质量菌粉活菌数（R2）。

 如表1所示，实验共选择８种常用保护剂进行三组平行单因素实验。通过单因素实验确定冻干保护剂适宜添加量，在此基础上筛选出对于存活率影响显著的保护剂种类，并对其进行响应面优化。

试验结果

（1）糖类单因素实验

 如图2所示，此菌泥的蔗糖适宜添加量为7％，海藻糖添加量为9％。

（2）益生元类单因素实验

 如图3所示，低聚半乳糖、低聚果糖、XOS、菊糖添加量分别为：8％、12％、16％、8％。

（3）无机盐类单因素实验

 如图4所示，根据单因素实验结果选择碳酸氢钠添加浓度1.0％，磷酸氢二钾添加浓度1.4％。

（4）筛选实验

 依据单因素实验结果，进行筛选实验，其中保护剂各因素水平如表2所示；保护剂PB设计及结果如表3所示；保护剂对R1（冻干存活率）的方差分析如表4所示；保护剂对R2（单位质量菌粉活菌数）的方差分析如表5所示。分析结果，选取D-菊糖、E-碳酸氢钠和B-XOS为保护剂组成分。

 如表4所示，D-菊糖、E-碳酸氢钠和B-XOS的F值较大，且D的p=0.0045＜0.01，为极显著性因素；E的p=0.0145＜0.05，为显著性因素；B的p=0.0549＜0.1，为重要因素，其它因素对混合乳酸菌泥冻干存活率的影响均不显著。

 如表5所示，B-XOS、C-低聚半乳糖、D-菊糖的F值较大，且D的p=0.0021＜0.01，为极显著性因素；B的p=0.0358＜0.05，C的p=0.0470＜0.05，为显著性因素。

（5）爬坡实验

 如表6所示，随着保护剂浓度的增大，R1逐渐增大，因此选择第5组为响应面中心点，分别为：B-XOS 14％；D-菊糖6％；E-碳酸氢钠0.9％。

（6）响应面优化实验

 中心组合设计因素与水平如表7所示；中心组合设计实验结果如表8所示；响应面二次模型的方差分析如表9所示。

对表７的实验结果建立回归模型并进行数据分析，得到以下回归模型方程：

 如表9所示，方程模型的p值为0.0013，表明模型显著，失拟项p＞0.1，表明失拟项不显著，无失拟因素存在，该模型有效，可用模型对数据进行分析。R2=0.9441，说明回归方程的拟合程度较好，回归分析有效，因此，用此回归方程来预测乳酸菌泥冻干存活率。

 如图5所示，XOS和菊糖的交互作用等高线近似圆形，且p=0.0233＜0.05，说明XOS和菊糖对混合乳酸菌冻干菌粉剂交互作用显著；XOS和碳酸氢钠的交互作用等高线为椭圆形，且p=0.2140＞0.05，说明XOS和碳酸氢钠对混合乳酸菌冻干菌粉剂交互作用不显著；菊糖和碳酸氢钠的交互作用等高线为椭圆形，且p=0.6685＞0.05，说明菊糖和碳酸氢钠对混合乳酸菌冻干粉剂交互作用不显著。

 通过响应面分析可知，当XOS添加量为14.5％、菊糖添加量为6.28％、碳酸氢钠添加量为0.92％时，预测乳酸菌菌泥的冻干存活率为79.80％。

（7）验证实验

 将嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、嗜热乳杆菌，以4%的接种量，接种比例2∶1∶2∶3∶4，接种到果渣浸提液中，在37～39 ℃下培养36～40 h，将菌液在5000 r/min下离心10 min得到菌泥，将添加保护剂的菌泥在-20 ℃下预冻２ h后冻干24 h。冻干得到最终存活率为82.87%±4.28%与预测值接近，与空白组（添加磷酸缓冲液，pH=7.4）相比乳酸菌菌泥的存活率提高了68.27%，表明响应面法优化乳酸菌泥冻干保护剂是可行的。

（8）冻干菌粉活力验证

 如图6所示，继代培养菌种发酵39 h与复水冻干菌粉发酵45 h的产酸量基本接近，说明采用实验中复合保护剂进行冻干处理可以保护乳酸菌的发酵活性。

试验结论

 总之，本文研究了含XOS冻干保护剂对乳酸菌冻干粉的影响，以乳酸菌泥为原料，以冻干粉的菌存活率（R1），单位质量菌粉活菌数（R2）为评价指标，通过单因素实验、Plackett-Burman试验、爬坡实验和响应面实验设计方案优化冻干保护剂配方。在乳酸菌泥中添加XOS、菊糖、碳酸氢钠且添加量分别为14.5％、6.28％、0.92％时，可使菌泥中乳酸菌的存活率达到82.87%±4.28％，较单一添加磷酸缓冲液提高了68.27％。以上结果表明，响应面法优化复合乳酸菌冻干保护剂配方是可行的，含XOS冻干保护剂可以显著提高乳酸菌冻干粉菌存活率。

参考资料：

杨辉, 闫晓哲, 杜姣姣, 等. 响应面法优化乳酸菌冻干保护剂配方[J].陕西科技大学学报, 2018, 36(02):31-38.