试验设计

       试验材料：干酪乳杆菌LZ183E、海藻糖、低聚木糖、脱脂乳粉和谷氨酸钠。

       冻干菌剂的制备：将保存的LZ183E菌液在MＲS液体培养基中37℃过夜活化3代，把活化后处于对数生长期的LZ183E以2%（体积分数）的接种量接种于优化后的MＲS培养基中，37℃高密度培养30 h，获得菌液备用；在无菌的条件下，取2 mL菌液于10 mL无菌离心管中，8000 r/min、4℃离心3 min，然后用灭菌生理盐水进行2次清洗，得到菌泥，再向含菌泥的10 mL离心管中加入2 mL已配制的冻干保护液，于－80℃冰箱中冻存6 h，然后迅速放入真空冷冻干燥机中干燥24 h以上，直至菌液冻干呈显棉絮状，得到冻干菌剂，此过程保持无菌。

       单一组分的冻干保护剂用量的确定：通过单因素试验考察海藻糖、脱脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸钠等保护剂的用量对LZ183E在冷冻过程中存活率的影响；制备冻干菌剂时，控制真空冷冻干燥机条件不变，以菌株存活率和菌剂产酸能力为指标，探究不同质量分数的海藻糖（2%、4%、6%、8%、10%）、低聚木糖（2%、4%、6%、8%和10%）、脱脂乳粉（2%、6%、10%、14%和18%）、谷氨酸钠（0.5%、1.0%、1.5%、2．0%和2.5%）对菌株LZ183E在冻干以后活力的影响，确定其适宜的浓度范围，并以未加保护剂为空白对照组（CK组）。

复配保护剂的响应面法优化：在单因素试验的基础上，以菌株存活率为指标，选取对菌株活性影响显著的3个因素进行3因素3水平的响应面试验进行复配优化，确定保护剂的最佳配比。

       测定方法：测定LZ183E在冷冻过程中的活菌数，再将冻干菌粉按原比例复溶进行试验，计算冻干前后菌株存活率；将冻干后的菌剂以3%的接种量加入灭菌后的脱脂牛奶中，37℃发酵12 h后测定发酵乳的pH值。

试验结果

（1）海藻糖用量对菌剂活力的影响

       由图1可知，海藻糖用量在2%～10%（质量分数）时对LZ183E在冻干过程的保护作用无显著差异（P＞0.05），菌株存活率处于波动状态，但冻干后菌株LZ183E仍然维持较高活力，其存活率在（93.479±1.667）%～（97.326±0.25）%，显著高于CK组（P＜0.05）。当海藻糖用量在6%（质量分数）时，对菌株的保护效果最好，并且此时菌剂的产酸能力也对应较强，发酵12 h后发酵乳的pH相对较低，为4.572±0.002，因此当海藻糖添加量为6%（质量分数）时对菌株的保护作用较好。

（2）低聚木糖用量对菌剂活力的影响

       由图2可知，随着低聚木糖用量的增加，LZ183E在冻干后的存活率表现出先上升后下降的趋势，在10%（质量分数）的添加量时具有最高存活率（96.081±0.395）%，明显高于CK组；尤其当用量从2%升至6%（质量分数）时，菌株存活率显著升高（P＜0.05），而此后随着用量进一步增大，其存活率的增加或降低并不显著（P＞0.05），表明低聚木糖在低浓度时其保护效果具有浓度差异性，而当过高时已经饱和对菌株的保护效果不明显；此外，菌剂在产酸能力上，随着低聚木糖用量的升高也表现出较强的产酸能力，发酵12 h后发酵乳pH可降低至4.5以下，这进一步表明低聚木糖可作为益生因子而促进LAB的生长代谢，因此，当低聚木糖添加量为10%（质量分数）时对菌株的保护作用较好。

（3）脱脂乳粉用量对菌剂活力的影响

       由图3可知，脱脂乳粉的保护作用存在用量依赖性，随脱脂乳粉用量的增加，LZ183E的存活率缓慢上升，在10%～14%（质量分数）趋于稳定，此时菌株存活率高于97%，而当高于14%的用量时存活率急剧下降（P＜0.05），但仍然高于CK组；且菌剂的产酸能力也表现出对应关系，菌株存活率越高，产酸能力越强，因此，当脱脂乳粉添加量为10%（质量分数）时对菌株的保护作用较好。

（4）谷氨酸钠用量对菌剂活力的影响

       由图4可知，谷氨酸钠用量在0.5%～1.5%（质量分数）时菌株保持着高于95%的存活率，当用量大于1.5%（质量分数）时干菌株存活率显著下降（P＜0.05），并且用量在2．5%（质量分数）时存活率最低，为（85.758±0.949）%，已经接近CK组，对菌株的保护作用表现出明显不足。此时产酸能力也相对较弱，但对整体产酸能力影响不大，因此，当谷氨酸钠添加量为1.5%（质量分数）时对菌株的保护作用较好。

（5）复配保护剂的响应面分析法优化结果

       通过分析单因素试验结果，控制海藻糖用量为6%，以L．casei LZ183E存活率为指标，进一步对低聚木糖、脱脂乳粉以及谷氨酸钠复配用量进行优化，其Box-Behnken设计表及结果分别见表1和表2。

软件Design Expert V 10对试验结果拟合的回归方程为Y=98.2268+0.55125X₁－0.320125X₂－0.350875X₃－1.063X₁X₂－0.1345X₁X₃－0.05775X₂X₃－1.346275X₁²－1.087025X₂²－0.207525X₃²，其方差分析结果如表3所示。

由表3可知，本实验建立的模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），因此模型可靠性较高；并且Ｒ²=0.9125，说明脱脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸钠对LZ183E存活率的影响显著；信噪比（signal-to-noise，S/N）=8.7284＞4，也从另一角度说明所建立的模型是可靠的；经方差分析，3个因素对凝固型发酵牛乳影响的主次顺序为X₁＞X₃＞X₂，即脱脂乳粉用量＞谷氨酸钠用量＞低聚木糖用量；研究表明，响应面的等高线越偏向椭圆，因素间交互作用越强；并且其呈现在闭合的椭圆或圆形，表明在试验范围内有最值。

由图5可知，当谷氨酸钠用量保持不变时，随着脱脂乳粉和低聚木糖用量的升高，菌株存活率均表现为先升后降，脱脂乳粉用量在8.5%～13.5%（质量分数）和低聚木糖量在6%～10.5%（质量分数）较为适宜；等高线呈现闭合椭圆且响应面为凸形，表明脱脂乳粉用量和低聚木糖用量交互作用显著，并且此区间内有最大值；当低聚木糖用量不变时，随着脱脂乳粉和谷氨酸钠用量的增大，菌株存活率也表现出先增后降的趋势，脱脂乳粉用量在8.7%～13.2%（质量分数）和谷氨酸钠用量在0.3%～1.75%（质量分数）较佳；此范围内等高线为闭合椭圆且响应面为凸形，说明脱脂乳粉用量和谷氨酸钠用量交互作用有最大值；当脱脂乳粉用量不变时，随低聚木糖和谷氨酸钠用量的增加，菌株存活率同样表现为先增后降的趋势，低聚木糖用量在7.1%～11.9%（质量分数），谷氨酸钠用量在0.4%～18%（质量分数）较佳；此时等高线的形状为闭合椭圆且响应面为凸形，说明在此区间内低聚木糖和谷氨酸钠交互作用强，并具有最大值；上述分析和表3中的显著性一致。

试验结论

在高密度培养的基础上，以干酪乳杆菌LZ183E为研究对象，菌株存活率和菌剂产酸能力为响应指标，通过单因素试验考察4种保护剂（海藻糖、低聚木糖、脱脂乳粉和谷氨酸钠）用量对菌株活力的影响，在此基础上采用响应面法对保护剂进行复配优化，并对最优条件下的菌剂的活力和产酸能力作出评价；结果表明，海藻糖、低聚木糖、脱脂乳粉以及谷氨酸钠对干酪乳杆菌LZ183E在冻干过程中有明显的保护效果，并且其最佳复配参数为海藻糖用量6.0%、低聚木糖用量8.5%、脱脂乳粉用量11.5%和谷氨酸钠用量1.0%（均为质量分数），此条件下菌株存活率为（98.236±0.137）%，显著高于未加保护剂的菌剂的存活率（79.241±0.382）%；在此最优配比下进行验证试验，菌株的存活率为（98.236±0.137）%，接近模型的预测值，证明此模型是可靠的。

参考资料：

周佳豪,雷文平,刘成国,周辉,周杏荣,叶望娟.高活菌数干酪乳杆菌LZ183E冻干保护剂的制备[J].食品与发酵工业,2020,46(24):138-143.